大黄素通过miR-429/SOX2轴调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2021.06.002

目的

大黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用，本文拟通过医学实验以及生物信息学分析方法探讨大黄素对肝癌细胞的作用以及分子机制。

方法

梯度浓度的大黄素处理肝癌细胞Huh7，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）与蛋白免疫印迹（Western blotting）方法检测miR-429与SOX2的表达以确定大黄素的处理浓度。合成过表达SOX2的质粒、miR-429 inhibitor、miR-429 mimics，然后转染至Huh7细胞，分别通过qPCR与Western blotting验证miR-429与SOX2的表达变化，并通过CCK-8、迁移和侵袭实验观察细胞功能变化。最后根据TargetScan软件预测的结合位点，利用双荧光素报告基因检测证实miR-429与SOX2的结合。

结果

与对照组相比，大黄素不同浓度（1、10、100 μmol/L）处理组均显著促进了miR-429的表达（P<0.05），抑制了SOX2的表达（P<0.05）。过表达SOX2质粒及miR-429 inhibitor均能促进SOX2的表达（P<0.05），同时促进Huh7细胞的增殖、迁移、侵袭；miR-429 mimics则降低了SOX2的表达（P<0.05）及细胞的增殖、迁移、侵袭能力。此外，miR-429可以直接结合SOX2。

结论

大黄素抑制了肝癌细胞的增殖和侵袭、迁移，具体的机制是通过促进miR-429的表达，进一步抑制SOX2的表达。

关键词: 大黄素, miR-429, SOX2, 肝癌, 增殖, 迁移, 侵袭

Objective

Emodin has anti-inflammatory, antioxidant and antitumor effects. This study discusses the effect and molecular mechanism of emodin on hepatocellular carcinoma cells by medical experimental methods and bioinformatics analysis.

Methods

Huh7 cells were treated with different concentrations, then real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and Western blotting were used to determine the expression of miR-429 and SOX2. SOX2 overexpression plasmid, miR-429 inhibitor and miR-429 mimics were synthesized and then transfected into Huh7 cells, and the expression changes of miR-429 and SOX2 were verified by qPCR and Western blotting, the functional changes of cells were observed by CCK-8 and transwell assay. Finally, according to the predicted binding site of TargetScan, the binding between miR-429 and SOX2 was confirmed by double luciferase reporter gene detection.

Results

Compared with the control group, emodin at different concentrations (1, 10, 100 μmol/L) significantly promoted the expression of miR-429 and inhibited the expression of SOX2 (P<0.05). Overexpression SOX2 plasmid and miR-429 inhibitor promoted the expression of SOX2 and the ability of proliferation, migration and invasion in Huh7 cells (P<0.05). Furthermore, miR-429 mimics decreased the expression of SOX2 (P<0.05) and the ability of cell migration and invasion. In addition, miR-429 was directly banded with SOX2.

Conclusion

Emodin regulates miR-429/SOX2 axis to inhibit the ability of proliferation, migration and invasion in liver cells.

Key words: Emodin, miR-429, SOX2, Liver cancer, Proliferation, Migration, Invasion

表1 引物序列信息

引物名称	序列(5'→3')	产物长度(bp)
APDH-F	GAGTCAACGGATTTGGTCGT
GAPDH-R	GACAAGCTTCCCGTTCTCAG	131
SOX2-F	TTTGTCGGAGACGGAGAAGC
SOX2-R	TAACTGTCCATGCGCTGGTT	237
miR-429-F	TAATACTGTCTGGTAAAACCGT
miR-429-R	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACACGGTT
universe-R	GTGCAGGGTCCGAGGT
U6-F	CGCTTCGGCAGCACATATAC
U6-R	CGAATTTGCGTGTCATCCTTG

表1 引物序列信息

引物名称	序列(5'→3')	产物长度(bp)
APDH-F	GAGTCAACGGATTTGGTCGT
GAPDH-R	GACAAGCTTCCCGTTCTCAG	131
SOX2-F	TTTGTCGGAGACGGAGAAGC
SOX2-R	TAACTGTCCATGCGCTGGTT	237
miR-429-F	TAATACTGTCTGGTAAAACCGT
miR-429-R	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACACGGTT
universe-R	GTGCAGGGTCCGAGGT
U6-F	CGCTTCGGCAGCACATATAC
U6-R	CGAATTTGCGTGTCATCCTTG

图1 大黄素促进肝癌细胞Huh7的miR-429的表达并抑制SOX2的表达　A为qPCR检测不同浓度的大黄素处理后miR-429与SOX2的表达变化；B为Western blotting检测不同浓度的大黄素处理后SOX2的表达变化；^* P<0.05

图2 大黄素通过抑制SOX2的表达抑制肝癌细胞Huh7的迁移、侵袭　A为qPCR检测SOX2的表达变化；B为Western blotting检测SOX2的表达变化；C为CCK-8检测细胞的增殖变化；D为Transwell检测Huh7细胞的迁移、侵袭变化；^* P<0.05

图3 大黄素通过上调miR-429的表达减少SOX2的表达，进而抑制肝癌细胞Huh7的迁移、侵袭　A为qPCR检测miR-429与SOX2的表达变化；B为Western blotting检测SOX2的蛋白表达变化；C为CCK-8检测Huh7细胞的增殖变化；D为Transwell检测Huh7细胞的迁移、侵袭变化；^* P<0.05

图4 miR-429通过直接靶向结合SOX2，以抑制SOX2的表达进而抑制肝癌细胞Huh7的迁移、侵袭　A为qPCR检测miR-429与SOX2的表达变化；B为Western blotting检测SOX2的表达变化；C为CCK-8检测Huh7细胞的增殖变化；D为Transwell检测Huh7细胞的迁移、侵袭变化；^* P<0.05

图5 miR-429与SOX2的3’UTR的结合位点　A为TargetScan预测miR-429与SOX2的3’UTR的结合位点；B为双荧光素报告基因检测荧光素酶活性变化；^* P<0.05

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Emodin regulating the proliferation, migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells through miR-429/SOX² axis

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