黄芪甲苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤和Caspase途径的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2016.03.002

目的

探讨黄芪甲苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）的保护作用以及相关机制。

方法

将75只纯系SD大鼠随机分为Sham组（假手术组）、HIRI组（缺血再灌注组）以及黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组，建立大鼠HIRI模型，于再灌注4、8、16 h后取下腔静脉血及肝左外叶组织。全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平；光学显微镜下观察肝细胞显微结构变化；Western Blotting及免疫组化染色分析肝组织中Caspase-3、8、9的表达；流式细胞仪检测肝细胞凋亡率。

结果

HIRI组的ALT和AST水平升高，而黄芪甲苷组明显降低，且肝细胞损伤明显减轻。高剂量组Caspase-3、8、9蛋白的表达水平以及细胞凋亡率明显低于HIRI组。

结论

黄芪甲苷预处理可减轻大鼠HIRI，其作用机制可能与其抑制Caspase-3、8、9的表达，从而抑制细胞凋亡有关。

关键词: 免疫化学, 再灌注损伤, 缺血, 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

Objective

To explore the protective effect of astragaloside Ⅳ on hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI) in rats.

Methods

Seventy-five SD rats were divided into Sham group (control group) , HIRI group (ischemia-reperfusion group) , and astragaloside Ⅳ groups (low dose group, middle dose group, and high dose group) , to establish the model of rat HIRI. After liver was reperfused with blood for 4 h, 8 h, and 16 h, specimens of blood and liver tissues were collected. Serum alanine aminotransferase (ALT) , aspertate aminotransferase (AST) was detected, the changes of liver cell micro-structure were observed under the optical microscope. Western Blotting and immunohistochemical staining was used to analyze the expression of Caspase-3, 8, 9 protein in liver tissues. The liver cell apoptosis rate was examined by flow cytometry.

Results

The levels of ALT, AST in HIRI group raised and in the drug groups decreased obviously. The liver cell damage significantly reduced in drug groups. Compared to HIRI group, the expression of Caspase-3, 8, 9 and apoptosis rate in high dose group were significantly reduced.

Conclusion

Astragaloside Ⅳ pretreatment can reduce HIRI in rats and its mechanism may be associated with inhibiting the expression levels of Caspase-3, 8, 9 and apoptosis inhibition.

Key words: Immunochemistry, Reperfusion injury, Ischemia, Caspases

表1 各组大鼠肝脏组织不同时间段血清ALT水平（U/L， ± s）

组别	例数	4h	t值	P值	8h	t值	P值	16 h	t值	P值
Sham组	5	58.04±1.21	25.14	<0.01	59.43±13.93	26.14	<0.01	56.67±4.56	7.36	<0.01
HIRI组	5	602.71±30.01	-	-	945±28.65	-	-	251.23±18.31	-	-
低剂量组	5	521.35±12.29	3.89	<0.05	654.55±19.58	4.21	<0.05	201.48±16.48	3.69	<0.05
中剂量组	5	252.19±15.39	4.50	<0.05	418.33±17.14	6.35	<0.01	100.58±19.35	2.95	<0.05
高剂量组	5	111.26±10.26	8.36	<0.01	178.99±11.39	19.58	<0.01	80.25±9.48	13.46	<0.01

表1 各组大鼠肝脏组织不同时间段血清ALT水平（U/L， ± s）

组别	例数	4h	t值	P值	8h	t值	P值	16 h	t值	P值
Sham组	5	58.04±1.21	25.14	<0.01	59.43±13.93	26.14	<0.01	56.67±4.56	7.36	<0.01
HIRI组	5	602.71±30.01	-	-	945±28.65	-	-	251.23±18.31	-	-
低剂量组	5	521.35±12.29	3.89	<0.05	654.55±19.58	4.21	<0.05	201.48±16.48	3.69	<0.05
中剂量组	5	252.19±15.39	4.50	<0.05	418.33±17.14	6.35	<0.01	100.58±19.35	2.95	<0.05
高剂量组	5	111.26±10.26	8.36	<0.01	178.99±11.39	19.58	<0.01	80.25±9.48	13.46	<0.01

表2 各组大鼠肝脏组织不同时间段血清AST水平（U/L， ± s）

组别	例数	4h	t值	P值	8h	t值	P值	16 h	t值	P值
Sham组	5	162.25±11.25	19.25	<0.01	163.48±1.48	21.78	<0.01	166.24±5.79	12.58	<0.01
低剂量组	5	719.16±1.15	2.96	<0.05	1245.22±2.27	3.15	<0.05	439.18±11.2	3.12	<0.05
中剂量组	5	542.12±21.28	4.32	<0.05	914.22±22.71	12.63	<0.01	201.24±11.25	2.81	<0.05
高剂量组	5	289.28±12.46	12.54	<0.01	412.74±8.24	21.47	<0.01	181.22±12.18	19.35	<0.01
HIRI组	5	989.15±13.25	-	-	1612.14±2.15	-	-	456.25±6.21	-	-

表2 各组大鼠肝脏组织不同时间段血清AST水平（U/L， ± s）

组别	例数	4h	t值	P值	8h	t值	P值	16 h	t值	P值
Sham组	5	162.25±11.25	19.25	<0.01	163.48±1.48	21.78	<0.01	166.24±5.79	12.58	<0.01
低剂量组	5	719.16±1.15	2.96	<0.05	1245.22±2.27	3.15	<0.05	439.18±11.2	3.12	<0.05
中剂量组	5	542.12±21.28	4.32	<0.05	914.22±22.71	12.63	<0.01	201.24±11.25	2.81	<0.05
高剂量组	5	289.28±12.46	12.54	<0.01	412.74±8.24	21.47	<0.01	181.22±12.18	19.35	<0.01
HIRI组	5	989.15±13.25	-	-	1612.14±2.15	-	-	456.25±6.21	-	-

图1 光学显微镜下不同时间点观察各组肝组织显微结构（HE染色×200），Sham组肝细胞形态正常、肝细胞索排列整齐，结构显示清晰（图1A、1D、1G）。术后4 h时，HIRI组中肝中央静脉周围的肝细胞轻度肿胀、部分出现变性坏死（图1B）；高剂量组中肝细胞未见明显损伤（图1C）。术后8 h时，HIRI组中肝中央静脉周围有肝细胞重度水肿、炎性细胞浸润、出现肝细胞大片坏死（图1E）；高剂量组肝细胞轻度水肿，少量炎性细胞浸润，基本无变性、坏死（图1F）。术后16 h时，HIRI组中肝细胞损伤减轻，部分发生凝固性坏死（图1H）；高剂量组中肝细胞轻度水肿、形态基本正常（图1I）

图2 各组肝组织中Caspase-3、8、9含量（1：Sham组4 h；2：Sham组8 h；3：Sham组16 h；4：HIRI组4 h；5：HIRI组8 h；6：HIRI组16 h；7：高剂量组4 h；8：高剂量组8 h；9：高剂量组16 h）

图5 肝组织中Caspase-9含量比较(#HIRI组灰度值与Sham组比较，P<0.05；*高剂量组灰度值与HIRI组比较，P<0.05)

图6 免疫组化染色法观察术后8 h时Caspase-3、8、9分别在Sham组、HIRI组、高剂量组肝脏组织中的表达情况(SABC ×200)

图9 高剂量组术后8 h流式细胞术双参数散点图

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Astragaloside Ⅳ protecting hepatic ischemia-reperfusion injury in rats through the Caspases pathway

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