芦荟多糖调控Th17/Treg细胞平衡缓解肠炎的实验研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2019.06.004

目的

探讨芦荟提取液芦荟多糖是否通过调节辅助性T细胞（Th17）与调节性T细胞（Treg）免疫失衡，缓解2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-TNBS）诱导的肠炎。

方法

用完全随机数字法将30只SD大鼠分成正常组（PBS液灌肠）、芦荟多糖治疗组（TNBS-乙醇液灌肠+肛门注入芦荟多糖）及模型组（TNBS-乙醇液灌肠），每组10只。记录大鼠体质量变化、疾病活动指数（DAI）。取结肠组织进行宏、微观损伤评分及病理学检查；检测结肠组织髓过氧化物酶（MPO）活性以及细胞因子转化生长因子（TGF-β）、白细胞介素（IL）-10、IL-17A、IL-6 mRNA的表达，转录因子RORγt、Foxp3⁺及信号转导和转录激活因子（STAT）3、5蛋白表达；检测血浆中细胞因子IL-1β、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、肿瘤坏死因子α刺激基因6（TSG-6）的表达。

结果

与模型组比较，芦荟多糖治疗组的DAI、MPO、组织病理学评分及血浆细胞因子IL-1β、TNF-α的蛋白表达显著降低，血浆TSG-6浓度增加。芦荟多糖抑制了结肠组织中促炎细胞因子IL-17A、IL-6 mRNA表达，以及转录因子RORγt活化及STAT3磷酸化，促进了抑炎细胞因子IL-10、TGF-βmRNA表达，以及Foxp3⁺表达及STAT5磷酸化。

结论

芦荟多糖可以通过纠正Th17/Treg细胞失衡，缓解TNBS诱导的实验性肠炎。

关键词: 炎症性肠病, 芦荟, 多糖类, Th17细胞, T淋巴细胞,调节

Objective

To investigate whether aloe polysaccharide from aloe extract can alleviate the enteritis induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) via correcting Th17/Treg cell imbalance.

Methods

Thirty SD rats were divided into normal group (enema with phosphate buffered saline), aloe polysaccharide treatment group (enema with TNBS and ethanol and anal injection of aloe polysaccharide) andmodel group (enema with TNBS and ethanol) by complete digital random method, with 10 rats in each group. The bodyweight change and disease activity index (DAI) were recorded. The macroscopic and microscopic damage scoring of colon tissue were examined histopathologically. The myeloperoxidase (MPO) activity, mRNA expression level of cytokine transforming growth factor (TGF-β), interleukin (IL)-10, IL-17A and IL-6, as well as the protein expression of transcription factors Foxp3⁺, RORγt and the signal transducer and activator of transcription (STAT)3, STAT5 were detected in the colon tissue. The expression of IL-1β, tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and anti-tumor necrosis factor alpha stimulating gene 6 (TSG-6) in the plasma were detected.

Results

Compared with the model group, DAI, MPO activity, histopathological scores and the protein expression of the plasma cytokines IL-1βand TNF-αin the aloe polysaccharide treatment group were significantly decreased, but the concentration of TSG-6 in the plasma was increased. Aloe polysaccharide inhibited the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines IL-17A and IL-6 as well as transcription factor RORγt activation and STAT3 phosphorylation in colon tissue, but promoted the mRNA expression of anti-inflammatory cytokines IL-10, TGF-βas well as transcription factor Foxp3⁺activation and STAT5 phosphorylation.

Conclusion

Aloe polysaccharide can alleviate TNBS-induced experimental enteritis by correcting Th17/Treg cell imbalance.

Key words: Inflammatory bowel disease, Aloe, Polysaccharides, Th17 cells, T-lymphocytes, regulatory

表1 大鼠肠炎模型的疾病活动指数(DAI)评分

相对体质量下降(%)	大便隐血实验	大便性状	分值
<1	阴性	正常	0
1~5	隐血阳性	软便	1
>5~10	阳性	大便松散	2
>10~15	阳性	稀糊样便	3
>15	肉眼血便	水样腹泻	4

表1 大鼠肠炎模型的疾病活动指数(DAI)评分

相对体质量下降(%)	大便隐血实验	大便性状	分值
<1	阴性	正常	0
1~5	隐血阳性	软便	1
>5~10	阳性	大便松散	2
>10~15	阳性	稀糊样便	3
>15	肉眼血便	水样腹泻	4

表2 目的基因的引物序列

基因名称	正向引物序列(5’→ 3’)	反向引物序列(5’→ 3’)
IL-17A	AAGCACAGAAAGCATGATCCG	GAGTCCAGGGTGAAGTGGA
IL-10	CCTTCCTCCGTGTGGTTTGA	TTCTTGAGGGCCACTTCGTA
IL-6	GCCAGATAGAGTCGTTGCCC	AGCTAGTTGCCGTGTGTCTG
TGF-β	CCCACATGAGATCAGCCTCC	GGAGTTGGGTGGCAAGAGTT
GAPDH	TCAATGAAGGGGTCGTTGAT	CGTCCCGTAGACAAAATGGT

表2 目的基因的引物序列

基因名称	正向引物序列(5’→ 3’)	反向引物序列(5’→ 3’)
IL-17A	AAGCACAGAAAGCATGATCCG	GAGTCCAGGGTGAAGTGGA
IL-10	CCTTCCTCCGTGTGGTTTGA	TTCTTGAGGGCCACTTCGTA
IL-6	GCCAGATAGAGTCGTTGCCC	AGCTAGTTGCCGTGTGTCTG
TGF-β	CCCACATGAGATCAGCCTCC	GGAGTTGGGTGGCAAGAGTT
GAPDH	TCAATGAAGGGGTCGTTGAT	CGTCCCGTAGACAAAATGGT

表3 三组大鼠治疗后相对体质量变化（%,±s）

组别	n	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天
正常组	10	100.35±0.12	100.58±0.41	100.93±0.62	101.79±1.61	101.88±0.67	102.17±0.55	102.37±0.67
治疗组	10	97.63±1.53	95.91±0.64	94.13±1.23^a	91.88±1.17^a	93.01±0.84^a	94.38±0.97^a	95.29±1.07^a
模型组	10	97.42±1.38	95.83±0.76	92.71±1.55	88.64±2.12	89.14±1.10	89.99±0.97	90.49±1.31
F值	?	14.501	151.281	107.553	131.066	427.723	436.696	256.323
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

表3 三组大鼠治疗后相对体质量变化（%,±s）

组别	n	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天
正常组	10	100.35±0.12	100.58±0.41	100.93±0.62	101.79±1.61	101.88±0.67	102.17±0.55	102.37±0.67
治疗组	10	97.63±1.53	95.91±0.64	94.13±1.23^a	91.88±1.17^a	93.01±0.84^a	94.38±0.97^a	95.29±1.07^a
模型组	10	97.42±1.38	95.83±0.76	92.71±1.55	88.64±2.12	89.14±1.10	89.99±0.97	90.49±1.31
F值	?	14.501	151.281	107.553	131.066	427.723	436.696	256.323
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

表4 三组大鼠治疗后疾病活动指数（DAI）评分变化（±s）

组别	n	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天
正常组	10	0	0	0	0	0	0	0
治疗组	10	1.40±0.24	5.54±0.62	6.96±0.58^a	6.31±0.54^a	5.05±0.60^a	3.61±0.47^a	2.16±0.38^a
模型组	10	1.47±0.20	5.89±0.95	8.02±0.38	8.16±0.37	7.94±0.39	7.46±0.62	6.92±0.28
F值	?	168.907	203.317	924.261	1025.488	761.962	543.174	1339.969
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

表4 三组大鼠治疗后疾病活动指数（DAI）评分变化（±s）

组别	n	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天
正常组	10	0	0	0	0	0	0	0
治疗组	10	1.40±0.24	5.54±0.62	6.96±0.58^a	6.31±0.54^a	5.05±0.60^a	3.61±0.47^a	2.16±0.38^a
模型组	10	1.47±0.20	5.89±0.95	8.02±0.38	8.16±0.37	7.94±0.39	7.46±0.62	6.92±0.28
F值	?	168.907	203.317	924.261	1025.488	761.962	543.174	1339.969
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

图1 芦荟多糖对IBD模型大鼠结肠宏观损伤的影响　A为结肠的长度测量，治疗组结肠长于模型组；B为结肠黏膜的宏观损伤，治疗组结肠黏膜炎性增厚，无溃疡、坏死，而模型组的结肠黏膜水肿、渗出、坏死；正常组黏膜完整、无水肿

表5 三组大鼠结肠长度、宏/微观损伤评分及髓过氧化物酶（MPO）表达（±s）

组别	n	微观损伤评分	宏观损伤评分	结肠长度(cm)	髓过氧化物酶(U/g)
正常组	10	0.50±0.06	0.17±0.04	21.78±1.16	60.55±7.97
治疗组	10	3.45±0.42^a	2.91±0.67^a	17.51±1.05^a	95.02±7.55^a
模型组	10	7.83±0.67	4.88±0.60	14.70±0.75	185.93±10.70
F值	?	568.530	166.573	100.823	428.205
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

表5 三组大鼠结肠长度、宏/微观损伤评分及髓过氧化物酶（MPO）表达（±s）

组别	n	微观损伤评分	宏观损伤评分	结肠长度(cm)	髓过氧化物酶(U/g)
正常组	10	0.50±0.06	0.17±0.04	21.78±1.16	60.55±7.97
治疗组	10	3.45±0.42^a	2.91±0.67^a	17.51±1.05^a	95.02±7.55^a
模型组	10	7.83±0.67	4.88±0.60	14.70±0.75	185.93±10.70
F值	?	568.530	166.573	100.823	428.205
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

图2 正置荧光显微镜下观察芦荟多糖对肠炎的病理学改变（苏木精-伊红染色　×100）　正常组结肠黏膜、腺体完整；治疗组见黏膜腺体增生，少量的炎性细胞浸润；模型组结肠黏膜腺体结构破坏，大量的炎性细胞浸润，肠壁增厚

表6 三组大鼠结肠组织中炎性细胞因子mRNA表达分析(2^-ΔΔCt,±s)

组别	n	TGF-β	IL-10	IL-17A	IL-6
正常组	10	1.06±0.09	1.06±0.04	1.05±0.03	1.06±0.04
治疗组	10	13.35±0.87^a	36.68±4.89^a	4.51±0.51^a	5.26±0.73^a
模型组	10	5.63±0.79	8.56±1.05	9.15±0.55	8.97±0.91
F值	?	667.392	298.547	707.291	704.120
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

表6 三组大鼠结肠组织中炎性细胞因子mRNA表达分析(2^-ΔΔCt,±s)

组别	n	TGF-β	IL-10	IL-17A	IL-6
正常组	10	1.06±0.09	1.06±0.04	1.05±0.03	1.06±0.04
治疗组	10	13.35±0.87^a	36.68±4.89^a	4.51±0.51^a	5.26±0.73^a
模型组	10	5.63±0.79	8.56±1.05	9.15±0.55	8.97±0.91
F值	?	667.392	298.547	707.291	704.120
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

图3 芦荟多糖对肠炎模型大鼠结肠组织内转录因子RORγt、Foxp3⁺、STAT3及STAT5蛋白表达的影响　A为Western blotting条带B为条带灰度值分析^*P<0.05

表7 三组大鼠血浆中细胞因子的表达分析(ng/L, ±s)

组别	n	IL-1β	TNF-α	TSG-6
正常组	10	86.14±9.20	146.50±8.31	87.71±10.26
治疗组	10	158.36±11.54^a	228.37±10.86^a	458.14±30.99^a
模型组	10	203.03±10.21	304.10±11.03	187.42±12.32
F值	?	259.782	483.139	724.107
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001

表7 三组大鼠血浆中细胞因子的表达分析(ng/L, ±s)

组别	n	IL-1β	TNF-α	TSG-6
正常组	10	86.14±9.20	146.50±8.31	87.71±10.26
治疗组	10	158.36±11.54^a	228.37±10.86^a	458.14±30.99^a
模型组	10	203.03±10.21	304.10±11.03	187.42±12.32
F值	?	259.782	483.139	724.107
P值	?	<0.001	<0.001	<0.001

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Experimental study of the aloe polysaccharides relieving enteritis by regulating Th17/Treg cell balance

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