circRNA-CHD2通过miR-30e-3p/MDM2/TP53轴促进胰腺癌侵袭转移

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2022.01.003

目的

探究circRNA-CHD2促进胰腺癌侵袭转移的机制。

方法

采用Kaplan-Meier曲线分析circRNA-CHD2的表达与胰腺癌患者临床病理特征及预后的相关性。通过划痕实验和Transwell实验分析circRNA-CHD2对胰腺癌细胞系侵袭转移功能的影响。采用生物信息学分析、RNA pull-down实验和qPCR实验证明circRNA-CHD2与miR-30e-3p的结合。

结果

与癌旁组织相比，circRNA-CHD2在胰腺癌组织中的表达显著升高（P<0.01）。circRNA-CHD2的高表达与胰腺癌患者的不良预后相关。体外功能实验表明，circRNA-CHD2的过表达可以促进胰腺癌的侵袭转移。进一步的机制实验提示，circRNA-CHD2能够竞争性结合miRNA-30e-3p，上调靶基因MDM2的表达，进一步抑制TP53的表达。

结论

circRNA-CHD2介导miR-30e-3p/MDM2/TP53轴调控胰腺癌的侵袭转移，其有望成为胰腺癌的生物学标志物和治疗靶点。

关键词: 胰腺肿瘤, circRNA, circRNA-CHD2, miR-30e-3p, MDM2

Objective

To reveal the mechanisms of circRNA-CHD2 promoting the metastasis of pancreatic cancer.

Methods

Kaplan-Meier curve was used to analyze the correlation between the expression of circRNA-CHD2 and the clinicopathological characteristics and prognosis of pancreatic cancer. The effect of circRNA-CHD2 on invasion and metastasis of pancreatic cancer cell line was analyzed by scratch test and Transwell test. Bioinformatics analysis, RNA pull-down assay and qPCR method were used to confirm the binding of circRNA-CHD2 and miR-30e-3p.

Results

There was a significantup-regulation of circRNA-CHD2 in pancreatic cancer tissues compared to tumor-adjacent tissues (P<0.01). Up-regulation of circRNA-CHD2 was correlated with poor prognosis of patients with pancreatic cancer. Functional tests showed that circRNA-CHD2 could promote pancreatic cancer cell metastasis in vitro. Mechanistically, circRNA-CHD2 functioned as a miR-30e-3p endogenous sponge and targetedmiR-30e-3p/MDM2/TP53 axis.

Conclusions

circRNA-CHD2 can promote metastasis of pancreatic cancer by regulating miR-30e-3p/MDM2/TP53 axis. Therefore, circRNA-CHD2 may serve as a prognostic biomarker and therapeutic target in pancreatic cancer.

Key words: Pancreatic neoplasms, Circular RNA, circRNA-CHD2, miR-30e-3p, MDM2

表1 引物序列

引物名称	序列（5’→3’）
circRNA-CHD2上游引物	TCACACAACCTTCACCCTCA
circRNA-CHD2下游引物	AGGACCCTGAGATCGCTTTG
GAPDH上游引物	CACATCGCTCAGACACCATG
GAPDH下游引物	TGACGGTGCCATGGAATTTG
CHD2上游引物	AAGCTTCGGGTTCAGACTCA
CHD2下游引物	CTCTTTGGCTTCTGGGAGGA
MDM2上游引物	ATGGGAGGCGTGTTCAGTAA
MDM2下游引物	GCAGCAGAGATGTGGGATTG
TP53上游引物	GATTTGATGCTGTCCCCGGA
TP53下游引物	GCACCACCACACTATGTCGA
miR-4778-3p	TGCTCTTCTTCCTTTGCAGAGTTGA
miR-5196-3p	TTCATCCTCGTCTCCCTCCCAG
miR-30e-3p	GCCTTTCAGTCGGATGTTTACAGC
miR-520a-5p	GACGCTCCAGAGGGAAGTACTTTCT
miR-525-5p	ATCGCTCCAGAGGGATGCACTTTCT
miR-6072	ATCGGTCCTCATCACACTGCACCTTAG
miR-20a-3p	CGCCGGACTGCATTATGAGCACTTAAAG
miR-124-3p	GCTAAGGCACGCGGTGAATGCCAA
miR-134-3p	CTGTGGGCCACCTAGTCACCAA

表1 引物序列

引物名称	序列（5’→3’）
circRNA-CHD2上游引物	TCACACAACCTTCACCCTCA
circRNA-CHD2下游引物	AGGACCCTGAGATCGCTTTG
GAPDH上游引物	CACATCGCTCAGACACCATG
GAPDH下游引物	TGACGGTGCCATGGAATTTG
CHD2上游引物	AAGCTTCGGGTTCAGACTCA
CHD2下游引物	CTCTTTGGCTTCTGGGAGGA
MDM2上游引物	ATGGGAGGCGTGTTCAGTAA
MDM2下游引物	GCAGCAGAGATGTGGGATTG
TP53上游引物	GATTTGATGCTGTCCCCGGA
TP53下游引物	GCACCACCACACTATGTCGA
miR-4778-3p	TGCTCTTCTTCCTTTGCAGAGTTGA
miR-5196-3p	TTCATCCTCGTCTCCCTCCCAG
miR-30e-3p	GCCTTTCAGTCGGATGTTTACAGC
miR-520a-5p	GACGCTCCAGAGGGAAGTACTTTCT
miR-525-5p	ATCGCTCCAGAGGGATGCACTTTCT
miR-6072	ATCGGTCCTCATCACACTGCACCTTAG
miR-20a-3p	CGCCGGACTGCATTATGAGCACTTAAAG
miR-124-3p	GCTAAGGCACGCGGTGAATGCCAA
miR-134-3p	CTGTGGGCCACCTAGTCACCAA

图1 circRNA-CHD2的鉴定　A为筛选在胰腺癌组织中高表达的circRNA示意图；B为82例胰腺癌患者胰腺癌组织和癌旁组织中circRNA-CHD2的相对表达；C为通过circBase数据库得到circRNA-CHD2在CHD2基因上的定位以及结构示意图；D~E为在PANC-1和CAPAN-2两个胰腺癌细胞系的cDNA中，分别用随机引物和oligo-dT引物反转录后，qPCR实验检测circRNA-CHD2的表达情况；F~G为用RNA酶处理PANC-1和CAPAN-2两个细胞系的RNA，通过qPCR检测其中circRNA-CHD2和CHD2 mRNA的表达情况。3次独立实验的标准差以误差线的形式表示。^*P<0.05，^**P<0.01

表1 circRNA-CHD2表达与82例胰腺癌患者临床病理特征的关系（例）

临床病理特征		例数	低表达	高表达	χ²值	P值
例数		82	41	41
性别					1.297	0.254
	男	51	23	28
	女	31	18	13
年龄（岁）					1.231	0.267
	≤60	45	25	20
	>60	37	16	21
分化程度					0.236	0.889
	低	31	15	16
	中	27	13	14
	高	24	13	11
淋巴转移					7.312	0.007^b
	无	23	17	6
	有	59	24	35
TNM分期					9.938	0.034^a
	Ⅰ	12	9	3
	Ⅱ	57	29	28
	Ⅲ	13	3	10

表1 circRNA-CHD2表达与82例胰腺癌患者临床病理特征的关系（例）

临床病理特征		例数	低表达	高表达	χ²值	P值
例数		82	41	41
性别					1.297	0.254
	男	51	23	28
	女	31	18	13
年龄（岁）					1.231	0.267
	≤60	45	25	20
	>60	37	16	21
分化程度					0.236	0.889
	低	31	15	16
	中	27	13	14
	高	24	13	11
淋巴转移					7.312	0.007^b
	无	23	17	6
	有	59	24	35
TNM分期					9.938	0.034^a
	Ⅰ	12	9	3
	Ⅱ	57	29	28
	Ⅲ	13	3	10

图2 circRNA-CHD2在胰腺癌中高表达并与不良预后相关　A为不同TNM分期的胰腺癌患者中circRNA-CHD2的相对表达；B为circRNA-CHD2的表达与患者总生存时间的关系；C为circRNA-CHD2的表达与患者无病生存时间的关系；组间差异显著性采用Mann-Whitney U检验比较，^*P<0.05，^**P<0.01

图3 circRNA-CHD2在体外促进胰腺癌侵袭迁移　A为circRNA-CHD2在正常胰腺和胰腺癌细胞系中的相对表达；B为circRNA-CHD2的敲除效率；C为Transwell实验验证circRNA-CHD2敲低对12 h后相对侵袭和迁移能力的影响；D为circRNA-CHD2敲低对12 h后划痕愈合百分比的影响。不同组间差异使用方差分析联合Dunnett-t检验比较，3次独立实验的标准差在图中以误差线的形式表示。^*P<0.05，^**P<0.01

图4 circRNA-CHD2通过miR-30e-3p/MDM2/TP53轴调控胰腺癌侵袭转移　A为通过miRanda数据库预测能够与circRNA-CHD2集合的miRNA；B为通过RNAalifold预测circRNA-CHD2的二级结构；C为RNA pull-down实验验证与circRNA-CHD2结合的miRNA；D为筛选miR-30e-3p下游靶基因的模式图；E为通过qPCR验证miR-30e-3p对MDM2表达的影响；F为通过Western blotting验证miR-30e-3p对MDM2表达的影响；G为qPCR验证miR-30e-3p对TP53表达的影响；H为敲低circRNA-CHD2对miR-30e-3p/MDM2/TP53轴的影响。3次独立实验的标准差在图中以误差线的形式表示。^*P<0.05，^**P<0.01

[1]	Vincent A, Herman J, Schulick R, et al. Pancreatic cancer[J]. Lancet, 2011, 378(9791): 607-620.
[2]	中国抗癌协会胰腺癌专业委员会. 胰腺癌综合诊治指南(2018版)[J]. 临床肝胆病杂志, 2018, 34(10): 2109-2120.
[3]	Ren B, Cui M, Yang G, et al. Tumor microenvironment participates in metastasis of pancreatic cancer[J]. Mol Cancer, 2018, 17(1): 108.
[4]	Suhail Y, Cain MP, Vanaja K, et al. Systems biology of cancer metastasis[J]. Cell Syst, 2019, 9(2): 109-127.
[5]	Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs[J]. Nat Rev Genet, 2019, 20(11): 675-691.
[6]	Wang Y, Liu J, Ma J, et al. Exosomal circRNAs: biogenesis, effect and application in human diseases[J]. Mol Cancer, 2019, 18(1): 116.
[7]	Meng S, Zhou H, Feng Z, et al. CircRNA: functions and properties of a novel potential biomarker for cancer[J]. Mol Cancer, 2017, 16(1): 94.
[8]	李玉婷，孔瑶，罗宇明, 等. 环状RNA-PCAC1促进胰腺导管腺癌侵袭转移的研究[J/CD]. 中华普通外科学文献（电子版）, 2020, 14(3): 174-179.
[9]	Chen LL. The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020, 21(8): 475-490.
[10]	Zhang HD, Jiang LH, Sun DW, et al. CircRNA: A novel type of biomarker for cancer[J]. Breast Cancer, 2018, 25(1): 1-7.
[11]	Weng W, Wei Q, Toden S, et al. Circular RNA ciRS-7-A promising prognostic biomarker and a potential therapeutic target in colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res, 2017, 23(14): 3918-3928.
[12]	李四桥，常清潭，刘海潮, 等. 环状RNA circ-MFN2在胰腺癌中的表达及其临床意义[J]. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(6): 762-767.
[13]	Kong Y, Li Y, Luo Y, et al. circNFIB₁ inhibits lymphangiogenesis and lymphatic metastasis via the miR-486-5p/PIK3R1/VEGF-C axis in pancreatic cancer[J]. Mol Cancer, 2020, 19(1): 82.
[14]	Wade M, Li YC, Wahl GM. MDM2, MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer, 2013, 13(2): 83-96.
[15]	Aubrey BJ, Strasser A, Kelly GL. Tumor-suppressor functions of the TP53 pathway[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2016, 6(5): a026062.

[1]	罗文斌, 韩玮. 胰腺癌患者首次化疗后中重度骨髓抑制的相关危险因素分析及预测模型构建[J/OL]. 中华普通外科学文献(电子版), 2024, 18(05): 357-362.
[2]	马中正, 杨云川, 马翔, 周迟, 丁丁, 霍俊一, 徐楠, 崔培元, 周磊. 胰腺癌双硫死亡相关的lncRNA预后模型的构建及免疫反应研究[J/OL]. 中华普通外科学文献(电子版), 2024, 18(05): 368-376.
[3]	付成旺, 杨大刚, 王榕, 李福堂. 营养与炎症指标在可切除胰腺癌中的研究进展[J/OL]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2024, 18(06): 704-708.
[4]	朱江, 张进, 孔云飞, 李军, 宋旭. 核梭杆菌和胰腺癌的关系及临床意义[J/OL]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2024, 18(04): 448-451.
[5]	史成宇, 季晓琳, 田莉莹, 张来香. 腹腔镜胰十二指肠切除术中第14c/d组淋巴结清扫在胰头癌中的临床效果研究[J/OL]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2024, 18(04): 430-433.
[6]	魏孔源, 仵正, 王铮, 黎韡. 机器人胰腺中段切除后远端胰腺消化道不同重建方式初探[J/OL]. 中华腔镜外科杂志(电子版), 2024, 17(05): 295-300.
[7]	曾聿理, 雷发容, 肖慧, 邱德亮, 谢静, 吴寻. 氯普鲁卡因通过调控circRNA-ZKSCAN1表达抑制肝癌Huh-7细胞体外生长和转移的研究[J/OL]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2024, 14(04): 220-228.
[8]	郭诗翔, 谭明达, 王槐志. 胰头癌淋巴结清扫再思考[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(05): 625-628.
[9]	张昊, 潘卫东. 胰腺癌新辅助化疗后可切除性评估现状及进展[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(05): 629-633.
[10]	周倜, 吴嘉, 韩方, 徐林伟, 张宇华. 新辅助治疗时代胰腺癌淋巴结清扫研究进展[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(05): 634-639.
[11]	王军华, 王锐炫. 胰腺癌新辅助化疗现状和治疗策略[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(05): 640-643.
[12]	魏妙艳, 徐近. 合并远处转移胰腺癌系统性治疗的梳理和展望[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(05): 644-650.
[13]	罗柳平, 吴萌萌, 陈欣磊, 林科灿. 胰腺全系膜切除在胰头癌根治术中的应用价值[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(05): 651-656.
[14]	张瑜, 姜梦妮. 基于DWI信号值构建局部进展期胰腺癌放化疗生存获益预测模型[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(05): 657-664.
[15]	董晓斌, 张静, 苏莎莎, 莎比亚·沙吾提, 盛好. 溃疡性结肠炎患者相关环状RNA 差异表达谱分析及功能研究[J/OL]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2024, 13(06): 499-509.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

circRNA-CHD2 promoting metastasis of pancreatic cancer via miR-30e-3p/MDM2/TP53 axis

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

circRNA-CHD2 promoting metastasis of pancreatic cancer via miR-30e-3p/MDM2/TP53 axis