circRNA-CHD2通过miR-30e-3p/MDM2/TP53轴促进胰腺癌侵袭转移

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2022.01.003

目的

探究circRNA-CHD2促进胰腺癌侵袭转移的机制。

方法

采用Kaplan-Meier曲线分析circRNA-CHD2的表达与胰腺癌患者临床病理特征及预后的相关性。通过划痕实验和Transwell实验分析circRNA-CHD2对胰腺癌细胞系侵袭转移功能的影响。采用生物信息学分析、RNA pull-down实验和qPCR实验证明circRNA-CHD2与miR-30e-3p的结合。

结果

与癌旁组织相比，circRNA-CHD2在胰腺癌组织中的表达显著升高（P<0.01）。circRNA-CHD2的高表达与胰腺癌患者的不良预后相关。体外功能实验表明，circRNA-CHD2的过表达可以促进胰腺癌的侵袭转移。进一步的机制实验提示，circRNA-CHD2能够竞争性结合miRNA-30e-3p，上调靶基因MDM2的表达，进一步抑制TP53的表达。

结论

circRNA-CHD2介导miR-30e-3p/MDM2/TP53轴调控胰腺癌的侵袭转移，其有望成为胰腺癌的生物学标志物和治疗靶点。

关键词: 胰腺肿瘤, circRNA, circRNA-CHD2, miR-30e-3p, MDM2

Objective

To reveal the mechanisms of circRNA-CHD2 promoting the metastasis of pancreatic cancer.

Methods

Kaplan-Meier curve was used to analyze the correlation between the expression of circRNA-CHD2 and the clinicopathological characteristics and prognosis of pancreatic cancer. The effect of circRNA-CHD2 on invasion and metastasis of pancreatic cancer cell line was analyzed by scratch test and Transwell test. Bioinformatics analysis, RNA pull-down assay and qPCR method were used to confirm the binding of circRNA-CHD2 and miR-30e-3p.

Results

There was a significantup-regulation of circRNA-CHD2 in pancreatic cancer tissues compared to tumor-adjacent tissues (P<0.01). Up-regulation of circRNA-CHD2 was correlated with poor prognosis of patients with pancreatic cancer. Functional tests showed that circRNA-CHD2 could promote pancreatic cancer cell metastasis in vitro. Mechanistically, circRNA-CHD2 functioned as a miR-30e-3p endogenous sponge and targetedmiR-30e-3p/MDM2/TP53 axis.

Conclusions

circRNA-CHD2 can promote metastasis of pancreatic cancer by regulating miR-30e-3p/MDM2/TP53 axis. Therefore, circRNA-CHD2 may serve as a prognostic biomarker and therapeutic target in pancreatic cancer.

Key words: Pancreatic neoplasms, Circular RNA, circRNA-CHD2, miR-30e-3p, MDM2

表1 引物序列

引物名称	序列（5’→3’）
circRNA-CHD2上游引物	TCACACAACCTTCACCCTCA
circRNA-CHD2下游引物	AGGACCCTGAGATCGCTTTG
GAPDH上游引物	CACATCGCTCAGACACCATG
GAPDH下游引物	TGACGGTGCCATGGAATTTG
CHD2上游引物	AAGCTTCGGGTTCAGACTCA
CHD2下游引物	CTCTTTGGCTTCTGGGAGGA
MDM2上游引物	ATGGGAGGCGTGTTCAGTAA
MDM2下游引物	GCAGCAGAGATGTGGGATTG
TP53上游引物	GATTTGATGCTGTCCCCGGA
TP53下游引物	GCACCACCACACTATGTCGA
miR-4778-3p	TGCTCTTCTTCCTTTGCAGAGTTGA
miR-5196-3p	TTCATCCTCGTCTCCCTCCCAG
miR-30e-3p	GCCTTTCAGTCGGATGTTTACAGC
miR-520a-5p	GACGCTCCAGAGGGAAGTACTTTCT
miR-525-5p	ATCGCTCCAGAGGGATGCACTTTCT
miR-6072	ATCGGTCCTCATCACACTGCACCTTAG
miR-20a-3p	CGCCGGACTGCATTATGAGCACTTAAAG
miR-124-3p	GCTAAGGCACGCGGTGAATGCCAA
miR-134-3p	CTGTGGGCCACCTAGTCACCAA

表1 引物序列

引物名称	序列（5’→3’）
circRNA-CHD2上游引物	TCACACAACCTTCACCCTCA
circRNA-CHD2下游引物	AGGACCCTGAGATCGCTTTG
GAPDH上游引物	CACATCGCTCAGACACCATG
GAPDH下游引物	TGACGGTGCCATGGAATTTG
CHD2上游引物	AAGCTTCGGGTTCAGACTCA
CHD2下游引物	CTCTTTGGCTTCTGGGAGGA
MDM2上游引物	ATGGGAGGCGTGTTCAGTAA
MDM2下游引物	GCAGCAGAGATGTGGGATTG
TP53上游引物	GATTTGATGCTGTCCCCGGA
TP53下游引物	GCACCACCACACTATGTCGA
miR-4778-3p	TGCTCTTCTTCCTTTGCAGAGTTGA
miR-5196-3p	TTCATCCTCGTCTCCCTCCCAG
miR-30e-3p	GCCTTTCAGTCGGATGTTTACAGC
miR-520a-5p	GACGCTCCAGAGGGAAGTACTTTCT
miR-525-5p	ATCGCTCCAGAGGGATGCACTTTCT
miR-6072	ATCGGTCCTCATCACACTGCACCTTAG
miR-20a-3p	CGCCGGACTGCATTATGAGCACTTAAAG
miR-124-3p	GCTAAGGCACGCGGTGAATGCCAA
miR-134-3p	CTGTGGGCCACCTAGTCACCAA

图1 circRNA-CHD2的鉴定　A为筛选在胰腺癌组织中高表达的circRNA示意图；B为82例胰腺癌患者胰腺癌组织和癌旁组织中circRNA-CHD2的相对表达；C为通过circBase数据库得到circRNA-CHD2在CHD2基因上的定位以及结构示意图；D~E为在PANC-1和CAPAN-2两个胰腺癌细胞系的cDNA中，分别用随机引物和oligo-dT引物反转录后，qPCR实验检测circRNA-CHD2的表达情况；F~G为用RNA酶处理PANC-1和CAPAN-2两个细胞系的RNA，通过qPCR检测其中circRNA-CHD2和CHD2 mRNA的表达情况。3次独立实验的标准差以误差线的形式表示。^*P<0.05，^**P<0.01

表1 circRNA-CHD2表达与82例胰腺癌患者临床病理特征的关系（例）

临床病理特征		例数	低表达	高表达	χ²值	P值
例数		82	41	41
性别					1.297	0.254
	男	51	23	28
	女	31	18	13
年龄（岁）					1.231	0.267
	≤60	45	25	20
	>60	37	16	21
分化程度					0.236	0.889
	低	31	15	16
	中	27	13	14
	高	24	13	11
淋巴转移					7.312	0.007^b
	无	23	17	6
	有	59	24	35
TNM分期					9.938	0.034^a
	Ⅰ	12	9	3
	Ⅱ	57	29	28
	Ⅲ	13	3	10

表1 circRNA-CHD2表达与82例胰腺癌患者临床病理特征的关系（例）

临床病理特征		例数	低表达	高表达	χ²值	P值
例数		82	41	41
性别					1.297	0.254
	男	51	23	28
	女	31	18	13
年龄（岁）					1.231	0.267
	≤60	45	25	20
	>60	37	16	21
分化程度					0.236	0.889
	低	31	15	16
	中	27	13	14
	高	24	13	11
淋巴转移					7.312	0.007^b
	无	23	17	6
	有	59	24	35
TNM分期					9.938	0.034^a
	Ⅰ	12	9	3
	Ⅱ	57	29	28
	Ⅲ	13	3	10

图2 circRNA-CHD2在胰腺癌中高表达并与不良预后相关　A为不同TNM分期的胰腺癌患者中circRNA-CHD2的相对表达；B为circRNA-CHD2的表达与患者总生存时间的关系；C为circRNA-CHD2的表达与患者无病生存时间的关系；组间差异显著性采用Mann-Whitney U检验比较，^*P<0.05，^**P<0.01

图3 circRNA-CHD2在体外促进胰腺癌侵袭迁移　A为circRNA-CHD2在正常胰腺和胰腺癌细胞系中的相对表达；B为circRNA-CHD2的敲除效率；C为Transwell实验验证circRNA-CHD2敲低对12 h后相对侵袭和迁移能力的影响；D为circRNA-CHD2敲低对12 h后划痕愈合百分比的影响。不同组间差异使用方差分析联合Dunnett-t检验比较，3次独立实验的标准差在图中以误差线的形式表示。^*P<0.05，^**P<0.01

图4 circRNA-CHD2通过miR-30e-3p/MDM2/TP53轴调控胰腺癌侵袭转移　A为通过miRanda数据库预测能够与circRNA-CHD2集合的miRNA；B为通过RNAalifold预测circRNA-CHD2的二级结构；C为RNA pull-down实验验证与circRNA-CHD2结合的miRNA；D为筛选miR-30e-3p下游靶基因的模式图；E为通过qPCR验证miR-30e-3p对MDM2表达的影响；F为通过Western blotting验证miR-30e-3p对MDM2表达的影响；G为qPCR验证miR-30e-3p对TP53表达的影响；H为敲低circRNA-CHD2对miR-30e-3p/MDM2/TP53轴的影响。3次独立实验的标准差在图中以误差线的形式表示。^*P<0.05，^**P<0.01

[1]	Vincent A, Herman J, Schulick R, et al. Pancreatic cancer[J]. Lancet, 2011, 378(9791): 607-620.
[2]	中国抗癌协会胰腺癌专业委员会. 胰腺癌综合诊治指南(2018版)[J]. 临床肝胆病杂志, 2018, 34(10): 2109-2120.
[3]	Ren B, Cui M, Yang G, et al. Tumor microenvironment participates in metastasis of pancreatic cancer[J]. Mol Cancer, 2018, 17(1): 108.
[4]	Suhail Y, Cain MP, Vanaja K, et al. Systems biology of cancer metastasis[J]. Cell Syst, 2019, 9(2): 109-127.
[5]	Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs[J]. Nat Rev Genet, 2019, 20(11): 675-691.
[6]	Wang Y, Liu J, Ma J, et al. Exosomal circRNAs: biogenesis, effect and application in human diseases[J]. Mol Cancer, 2019, 18(1): 116.
[7]	Meng S, Zhou H, Feng Z, et al. CircRNA: functions and properties of a novel potential biomarker for cancer[J]. Mol Cancer, 2017, 16(1): 94.
[8]	李玉婷，孔瑶，罗宇明, 等. 环状RNA-PCAC1促进胰腺导管腺癌侵袭转移的研究[J/CD]. 中华普通外科学文献（电子版）, 2020, 14(3): 174-179.
[9]	Chen LL. The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020, 21(8): 475-490.
[10]	Zhang HD, Jiang LH, Sun DW, et al. CircRNA: A novel type of biomarker for cancer[J]. Breast Cancer, 2018, 25(1): 1-7.
[11]	Weng W, Wei Q, Toden S, et al. Circular RNA ciRS-7-A promising prognostic biomarker and a potential therapeutic target in colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res, 2017, 23(14): 3918-3928.
[12]	李四桥，常清潭，刘海潮, 等. 环状RNA circ-MFN2在胰腺癌中的表达及其临床意义[J]. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(6): 762-767.
[13]	Kong Y, Li Y, Luo Y, et al. circNFIB₁ inhibits lymphangiogenesis and lymphatic metastasis via the miR-486-5p/PIK3R1/VEGF-C axis in pancreatic cancer[J]. Mol Cancer, 2020, 19(1): 82.
[14]	Wade M, Li YC, Wahl GM. MDM2, MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer, 2013, 13(2): 83-96.
[15]	Aubrey BJ, Strasser A, Kelly GL. Tumor-suppressor functions of the TP53 pathway[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2016, 6(5): a026062.

[1]	赵之明, 尹注增, 刘荣. 胰腺癌转化治疗及机器人胰体尾癌根治性切除[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2023, 17(02): 160-160.
[2]	石思雅, 冯仕庭, 沈冰奇. 胰腺导管腺癌间质纤维化靶向治疗和无创评估的研究现状[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2022, 16(06): 443-447.
[3]	宁涓, 王晓燕, 魏华萍. 白蛋白结合型紫杉醇治疗转移性胰腺癌的疗效观察[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2022, 16(06): 407-411.
[4]	贾成朋, 王代宏, 陈华, 孙备. 可切除性胰腺癌预后术前预测模型的建立及应用[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(05): 566-570.
[5]	韩显林. 完全腹腔镜根治性胰十二指肠切除术（联合肠系膜上静脉切除人工血管重建）[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 133-133.
[6]	李泽乾, 郝少龙, 张博, 纪凯伦, 韩威. 外周血非编码RNA在胰腺癌中研究进展[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 217-220.
[7]	张博, 韩威, 郝少龙, 李泽乾, 纪智礼. 竞争内源性RNA在胰腺癌研究中的进展[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 213-216.
[8]	郭伟林, 李运涛, 尚培中, 李晓武, 李伟. 胰腺癌S100A4和Midkine表达研究[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 149-152.
[9]	张原, 李小龙, 王亚鹏. 胰腺癌中ANGPTL2蛋白与免疫抑制细胞浸润的关系及临床意义[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 145-148.
[10]	李永宁, 付雪芹, 李英, 刘鹏, 刘松柏, 潘耀振. 基因相似序列家族成员126A靶向调控波形蛋白促进胰腺癌细胞侵袭和迁移及其机制[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 139-144.
[11]	毛永欢, 奚玲, 陆晨, 刘理想, 喻春钊, 沈晓菲. PI3K/Akt信号通路通过Plk1影响胰腺癌细胞PANC-1对吉西他滨的化疗敏感性[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 135-138.
[12]	韩显林, 林伯铮, 洪夏飞. 腹腔镜胰腺癌手术研究进展及血管解剖要点[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 129-132.
[13]	田锋, 郭俊超. 中国微创技术在胰腺癌手术中的应用现状和展望[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 124-128.
[14]	张太平, 翁桂湖, 刘悦泽. 不断推进中国腹腔镜胰腺癌手术规范化[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2023, 17(02): 120-123.
[15]	王迪, 吕少诚, 黄金灿, 潘飞, 姜涛, 郎韧. 肺腺癌胰腺转移伴门静脉侵犯一例[J]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2023, 12(04): 457-460.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

circRNA-CHD2 promoting metastasis of pancreatic cancer via miR-30e-3p/MDM2/TP53 axis

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

circRNA-CHD2 promoting metastasis of pancreatic cancer via miR-30e-3p/MDM2/TP53 axis