成石饮食诱发胆结石及肝损伤机制的研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2025.01.007

目的

在小鼠模型基础上，探索成石饮食诱发胆结石及肝损伤的机制。

方法

将12只C57BL/6J 小鼠以随机数字表法分为成石组和对照组，每组6 只。成石组喂养成石饲料，构建胆结石及肝损伤模型；对照组给予普通饲料。取肝脏进行苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学（IHC）染色，采用免疫印迹（WB）、实时荧光定量PCR（qPCR）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、流式细胞术等技术进行检测。

结果

与对照组相比，成石组小鼠胆囊出现结石，肝脏病理检测显示肝损伤明显，血清碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、胆红素（bilirubin）和胆汁酸（BA）水平显著升高（P＜0.05）；Ⅱ型一氧化氮合酶（NOS2）、白细胞介素1β（IL-1 β）的mRNA 水平表达显著上升（P＜0.001），AML12 细胞乳酸脱氢酶、活性氧表达量明显提升（P＜0.000 1）；肝脏核因子κB（NF-κB）信号通路明显激活，M1 型巨噬细胞极化明显。

结论

成石饲料诱导的小鼠胆结石及肝损伤可促进M1 型巨噬细胞极化，进一步介导肝细胞损伤。

关键词: 成石饮食, 胆结石, 肝损伤, 巨噬细胞极化, NF-κB 信号通路

Objective

To investigate the mechanisms underlying gallstone formation and liver injury induced by the lithogenic diet using a mouse model.

Methods

Twelve C57BL/6J mice were divided into two groups by random number table method： stone-forming group and control group， with six mice in each group.The stone-forming group was fed a lithogenic diet that promoted gallstone formation to establish a model of gallstone-induced liver injury， while the control group received a regular diet.Liver tissues were stained with hematoxylin-eosin staining （HE） and immunohistochemical staining （IHC）， and analyzed using Western blotting （WB）， quantitative real-time PCR （qPCR）， enzyme linked immunosorbent assay （ELISA），flow cytometry， and other techniques.

Results

Compared to the mice in the control group， those in the stone-forming group exhibited gallstones.Pathological examination of their livers revealed significant liver injury.Additionally， levels of serum alkaline phosphatase （ALP）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， bilirubin， and bile acid （BA） were significantly elevated.The mRNA levels of nitric oxide synthase 2 （NOS2） and interleukin-1β （IL-1β） were significantly increased （P＜0.001）， and the expression levels of lactate dehydrogenase （LDH） and reactive oxygen species （ROS） in AML12 cells were significantly increased （P＜0.000 1）.Activation of the nuclear factor kappa-B （NF-κB） signaling pathway in the liver was observed along with polarization towards M1-type macrophages.

Conclusion

The consumption of a lithogenic diet leads to gallstone formation and subsequent liver injury through promoting M1-type macrophage polarization which further mediates hepatocyte damage.

Key words: Lithogenic diet, Cholecystolithiasis, Liver injury, Macrophage polarization, NF-κB signaling pathway

表1 引物序列

基因名称	引物序列
Arg1	正向CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG
	反向GGAGCTGTCATTAGGGACATCA
Ym1	正向CAGGGTAATGAGTGGGTTGG
	反向AAAGAACCACTGAAGTCATCCA
NOS2	正向GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA
	反向GTGGACGGGTCGATGTCAC
IL-1β	正向GAAATGCCACCTTTTGACAGTG
	反向TGGATGCTCTCATCAGGACAG
β-actin	正向GGCTGTATTCCCCTCCATCG
	反向CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

表1 引物序列

基因名称	引物序列
Arg1	正向CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG
	反向GGAGCTGTCATTAGGGACATCA
Ym1	正向CAGGGTAATGAGTGGGTTGG
	反向AAAGAACCACTGAAGTCATCCA
NOS2	正向GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA
	反向GTGGACGGGTCGATGTCAC
IL-1β	正向GAAATGCCACCTTTTGACAGTG
	反向TGGATGCTCTCATCAGGACAG
β-actin	正向GGCTGTATTCCCCTCCATCG
	反向CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

^***P＜0.001，^****P＜0.000 1

图2 对照组和LD 组小鼠的肝脏组织巨噬细胞特异性蛋白表达结果 A 为流式细胞术检测肝脏中M1 和M2 型巨噬细胞数量差异；B～E 分别为小鼠肝脏Arg1、Ym1、NOS2、IL-1β 的qPCR 结果，^***P＜0.001，ns 差异无统计学意义

图3 正常和肝胆结石小鼠的p-p65^ser536 和p65 的蛋白表达结果 A 为免疫组织化学检测小鼠肝脏p-p65^ser536 和p65 水平（400×）及其量化图；B 为免疫印迹分析检测小鼠肝脏p-p65^ser536 和p65 水平；C～F 为qPCR 检测Ana-1细胞与两组小鼠肝细胞共培养后NOS2、IL-1β、Arg-1、Ym1 的相对表达量；G～H 分别为NOS2 和IL-1β 的表达量；I 为Ana-1 细胞与两组小鼠肝细胞共培养后p-p65^ser536 和p65 蛋白表达结果；J 为细胞LDH 活性检测；K 为流式细胞术检测细胞的ROS 水平；L 为免疫印迹分析检测AML12与Ana-1 或M1 共培养后p-p65^ser536 和p65 蛋白表达结果；ns 表示差异无统计学意义；^**P＜0.01，^****P＜0.000 1

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