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中华普通外科学文献(电子版)

中华普通外科学文献(电子版) ›› 2014, Vol. 08 ›› Issue (03) : 185 -190. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2014.03.003

所属专题： 文献；

论著

Rac1基因真核表达质粒的构建及其对结肠癌细胞生物学功能的影响
叶志强1, 陈怡2, 陈亚琼3, 刘波4,†()   
  1. 1. 510630　广州，中山大学附属第三医院急诊科
    2. 中山大学附属孙逸仙纪念医院甲乳外科
    3. 510630　广州，中山大学附属第三医院检验科
    4. 中山大学第三附属医院萝岗分院普外科
  • 收稿日期:2014-03-10 出版日期:2014-06-01
  • 通信作者: 刘波
  • 基金资助:
    广东省科技计划项目(2011B061300011)

Construction of eukaryotic expression plasmid for Rac1 gene and its effect on the biological function of colon cancer cells

Zhiqiang Ye1, Yi Chen2, Yaqiong Chen3, Bo Liu4,†()   

  1. 1. Department of Emergency, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China
  • Received:2014-03-10 Published:2014-06-01
  • Corresponding author: Bo Liu
  • About author:
    Corresponding author: Liu Bo, Department of General Surgery, Luogang Branch, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China, Email:
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引用本文：

叶志强, 陈怡, 陈亚琼, 刘波. Rac1基因真核表达质粒的构建及其对结肠癌细胞生物学功能的影响[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2014, 08(03): 185-190.

Zhiqiang Ye, Yi Chen, Yaqiong Chen, Bo Liu. Construction of eukaryotic expression plasmid for Rac1 gene and its effect on the biological function of colon cancer cells[J]. Chinese Archives of General Surgery(Electronic Edition), 2014, 08(03): 185-190.

目的

应用分子生物学技术构建Rac1基因真核表达质粒及小分子RNA（siRNA）干扰片段，通过调控其表达，研究Rac1蛋白对结肠癌细胞生物学功能的影响。

方法

从结肠癌细胞中扩增Rac1基因，构建pCDNA3.1(+)-Rac1和pEGFP-Rac1真核表达质粒实现过表达Rac1基因；通过小分子RNA干扰抑制Rac1基因表达。利用侵袭实验、划痕实验研究Rac1基因对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的改变；通过Pull-Down实验，研究调控Rac1表达对癌细胞中GTPase活性的影响。

结果

成功构建Rac1基因真核表达质粒。通过调控Rac1蛋白的表达证实其与结肠癌细胞中Rac1 GTPase的活化程度，以及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力呈正性关联。

结论

通过抑制Rac1的表达，可以有效阻止Rac1 GTPase的激活，从而抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭，为抑制结肠癌进展提供新的干预靶点，也为进一步免疫生物过继治疗提供了必要的实验基础。

关键词: 结肠癌, Rac1基因, 真核表达质粒, GTPase
Objective

To reveal the role of Rac1 gene regulating colon cancer cell invasion and migration.

Methods

Rac1 gene was amplified from colon cancer cells, and then constructed to pCDNA3.1(+)-Rac1 and pEGFP-Rac1 eukaryotic expression plasmid for overexpressed Rac1 protein. Meanwhile, siRNA was used to inhibit Rac1 gene expression. After transfecting Rac1-plasmid or siRNA into cells, Matrigel invasion, wound healing and Pull-down assays were performed to investigate the alteration of invasion, migration and Rac1 GTPase activity in colon cancer cells, respectively.

Results

A eukaryotic expression plasmid containing Rac1 gene was successfully constructed. Up or down-regulation of Rac1 expression could stimulate or block GTPase activation, and Rac1 gene had the ability to modulate the migration and invasion of colon cancer cells.

Conclusions

Our study provides a potential target that gene Rac1 plays the synergistic role with conventional therapy in colon cancer by suppressing Rac1 expression.

Key words: Colon cancer, Rac1 gene, Eukaryotic expression plasmid, GTPase
图1 Rac1基因RT-PCR扩增结果
图2 重组质粒限制性内切酶消化鉴定结果
图3 重组质粒pEGFP-Rac1转染LOVO细胞24h后，荧光显微镜下观察可见明显的绿色荧光
图4 转染pCDNA3.1(+)-Rac1 48 h或Rac1 siRNA干扰72 h后，各组LOVO细胞中Rac1 mRNA表达的半定量RT-PCR结果Control：未转染组；+Rac1：转染组；-Rac1：干扰组
图5 转染pCDNA3.1(+)-Rac1 48 h或Rac1 siRNA干扰72 h后，各组LOVO细胞中Rac1蛋白表达的Western Blot结果。Control：未转染组；+Rac1：转染组；-Rac1：干扰组
图6 LOVO细胞转染pCDNA3.1(+)-Rac1质粒及Rac1 siRNA干扰后24h划痕试验( P < 0.01)
图7 Transwell侵袭小室实验检测穿越基底膜癌细胞数。左：空白组；中：Rac1 siRNA干扰组；右：pCDNA3.1(+)-Rac1转染组
图8 Rac1 pull-down实验检测Rac1活性变化的Western Blot结果。左：Rac1 siRNA干扰组；中：空白组；右：pCDNA3.1(+)-Rac1转染组
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